ScienceDirect抗猪圆环病毒2型衣壳蛋白单域抗体片段筛选与鉴定

猪圆环病毒2型(PCV2)在世界范围内的猪生产国广泛存在，自从被确定为断奶后多系统衰竭综合征的病原体以来，已被认为是养猪业中最具经济价值的病毒病原体之一。PCV2是该家族圆环病毒属的成员圆环病毒科，它是由两个主要开放阅读框(ORF)组成的单链、无包膜、环状DNA病毒。ORF1编码病毒复制酶蛋白，ORF2编码主要结构衣壳蛋白，该衣壳蛋白是参与宿主免疫反应的类型特异性表位的主要载体,在本研究中，从猪圆环病毒2型(PCV2)疫苗免疫的双峰驼构建了VHH文库，并选择和鉴定了PCV2 (PCV2 Cap)衣壳蛋白的三个特异性VHH片段。

VHH基因克隆及VHH文库的建立

通过三轮PCR扩增VHH区。针对PCV2的VHH文库，命名为NAL-PCV2，通过将最终PCR片段插入载体pHEN2并转化到大肠杆菌TG1细胞中而生成。PCR筛选显示，93%的克隆含有具有骆驼VHH基因预期大小插入物的质粒。通过在作为克隆插入物一部分的CDR中测序来检查来自文库的克隆的多样性。每个克隆包含不同的CDR序列。文库的容量是正克隆数计算的容量的10 8。扩增NAL-PCV2，然后培养并感染M13KO7辅助噬菌体，之后获得噬菌体展示文库。

可溶性VHH的生产和纯化

将来自分离克隆的三个VHH DNA序列插入SUMO载体，并转化到 BL21-codon-Plus (DE3)-RIL细胞中。用IPTG诱导后，可溶性蛋白带约如SDS-PAGE上的考马斯蓝染色所示，在含有重组DNA的诱导大肠杆菌中明显存在35kDa的大小（图4A）。从超声波破碎的细胞中提取表达的蛋白质，并通过SDS-PAGE进行可视化（图4B）。通过ND2000在280nm处的吸收测量，计算出每升大肠杆菌培养物3毫克至5毫克纯化蛋白的产量。还使用HRP缀合物抗His小鼠单克隆抗体通过WB检测靶蛋白的表达（图4C）。

图4.表达和纯化

鉴于高表达率的特性，溶解度、高抗原特异性和亲和力，以及最大稳定性，VHH抗体已被广泛使用进一步研究和发现更多VHH特性将扩展其应用范围。在我们的研究中，成功地使用了三种抗PCV2 VHH其选自免疫的杆菌。ELISA试验SPR显示出高特异性和亲和力具有PCV2 Cap的VHH cs，建议选择VHH-cs可能是一种有前景的PCV2诊断试剂侦查此外，所选VHH cs是有用的用于进一步发现更多VHH特性的资源。