J. Future Foods | 液相色谱-串联质谱法测定畜禽肉中的成分

Introduction

畜禽肉品种繁多，蛋白质含量约为10%-20%。它富含B族维生素和不饱和脂肪酸，是人体蛋白质和微量元素的重要来源。畜禽肉及其制品在中国占有较大的消费市场，如2018年消费肉类7 469.8万吨。在需求旺盛的情况下，畜禽肉制品掺假问题暴露出来，引起了消费者的极大关注。2013年“马肉风暴”期间，全球肉类产品安全问题备受关注。非法摊贩将鸡、猪、鸭等低价肉和牛、羊、鹿等其他高价肉制品混搭在一起，并使用低价肉或非肉类原料加工后伪装成高价肉。利用非原产产品冒充原产产品等，牟取暴利，严重侵犯消费者权益，引起穆斯林等宗教信仰者的不满，造成严重的社会安全问题。因此，建立肉制品来源成分的定性定量方法，对肉制品质量的鉴定和肉制品质量的真实性具有重要意义。

检测动物源性成分有几种分析方法，包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、聚合酶链反应（PCR）等。荧光PCR方法被广泛使用，也是当前国家和行业标准中最常用的方法。抗体的性质会影响ELISA技术的灵敏度和准确性。由于食品基质复杂，加工过程可能导致蛋白质变性，这种方法容易出现假阳性。PCR方法容易受到复杂样品基质、DNA降解等的影响，并且容易出现假阴性和假阳性问题。

质谱已广泛应用于小分子分析领域，而基于特征肽的质谱是近年来兴起的一种新的源成分检测方法，一些学者建立了基于特征肽的牛肉、马肉和鸡肉源成分测定方法。基于特征肽的质谱法能有效解决基质干扰和假阳性问题，是畜禽肉成分检测的一种较为有效的方法。

本研究采用高效液相色谱-串联质谱法建立了鸡、鸭、猪肉、牛肉和羊肉的成分。采用酶消化法从畜禽肉样品中提取肽。通过寻找特征肽，建立了基于多反应监测模式的分析方法。对所建立的方法进行了验证，并将其应用于实际样品的测定，实现了从畜禽肉中鉴别成分的目的。该方法具有特异性强、灵敏度高的特点，具有良好的应用前景。

Results and discussion

特征肽的筛选

本研究选用胰蛋白酶对畜禽肉蛋白进行酶解，并将胰蛋白酶切割成C端赖氨酸和精氨酸。肽的选择有几个基本原则：肽的长度通常在7-20 个氨基酸之间，没有错误切割或遗漏酶位点，应避免半胱氨酸和蛋氨酸等不稳定氨基酸，重复性好。所选肽必须是唯一的且不受干扰。将肽的鉴定结果与Uniprot数据库信息进行比较，最终羊肉鉴定为3 个肽，牛肉鉴定为2 个肽，猪肉鉴定为3 个特征肽，鸭子鉴定为8 个特征肽，鸡肉鉴定为3 个特征肽，表1和图1列出了所有鉴定的肽。

表1 羊肉、牛肉、猪肉、鸭子、鸡肉的特征肽信息

图1 对Q精密质谱法鉴定的羊肉、牛肉、猪肉、鸭和鸡中肽的氨基酸序列进行了分析

MRM条件的优化

通过高分辨率质谱获得特征多肽的精确质量数，并通过液相色谱-串联质谱进行验证。通过产物扫描模式获得碎片离子，并通过优化团簇去除电压、碰撞能量等参数获得最佳质谱参数。MS的所有参数如表2所示。所有分析物的提取离子色谱图如图2所示。

表2 羊肉、牛肉、猪肉、鸭、鸡特征肽的MRM参数

图2 羊肉（A、B）、牛肉（C、D）、猪肉（E、F、G）、鸭子（H、I、J）和鸡肉（K、L、M）特征肽的色谱-质谱分析

方法验证

鸭肉、猪肉和鸡肉是羊肉和牛肉制品中最常见的掺假成分。该方法用于定量研究羊肉和牛肉中掺假成分的检测，即分别考察羊肉和牛肉中鸭肉、猪肉和鸡肉的检出限、定量限和回收率。对于每个物种，选择响应强度最高的特征肽进行方法学研究。

方法的特异性

为了研究该方法的特异性，检测了肽标准品和掺有内标物的胰蛋白酶样品。合成肽标准品和从胰蛋白酶样品中选择的特征肽中有尖锐对称的峰，而未经胰蛋白酶消化的样品中没有峰。基质成分对肽标准品的保留时间没有干扰，表明该方法具有良好的特异性。

为了调查该方法的适用性，对市场上随机抽取的15 个羊肉样品（包括羊肉卷、羊肉串和羊肉）和15 个牛肉样品（包括牛肉卷、牛肉串和牛肉）进行了测试。结果表明，筛选结果良好，仅在羊肉和牛肉样品中检测到羊肉和牛肉的特征肽，而在鸭肉、猪肉和鸡肉中未检测到特征肽。

Conclusion

本研究采用Easy nLC 1000-Q Exactive和UPLC-MS/MS相结合的方法，从5 种肉类中筛选出19 种特征肽，建立了羊肉和牛肉中特征肽的鉴定和定量测定方法。该方法具有预处理简单、干扰少、灵敏度高、回收率高等优点。基于这一原理，可以同时对多种肉类进行鉴别，为掺假检测提供了强大的研究平台，可以与其他技术进行补充，在食品真伪鉴别领域具有广阔的市场应用前景。

Determination of ingredients in livestock and poultry meat based on liquid chromatography-tandem mass spectrometry

Liangna He, Junmei Ma, Qiang Li, Liming Wang, Sufang Fan*, Yan Zhang*

Hebei Food Safety Key Laboratory, Key Laboratory of Special Food Supervision Technology for State Market Regulation, Hebei Engineering Research Center for Special Food Safety and Health, Hebei Food Inspection and Research Institute, Shijiazhuang 050227, China

*Corresponding author.

E-mail address: fansufang@nepp.com.cn; snowwinglv@126.com

Abstract

A liquid chromatography-tandem mass spectrometry method was established for the determination of ingredients of chicken, duck, pork, beef and mutton. A total of 19 characteristic peptides were screened out from 5 kinds of meat, and a liquid chromatography-tandem mass spectrometry method was established for the determination of characteristic peptides. The accuracy of the method was tested by adding duck, pork and chicken with the mass fractions of 0.5%, 1% and 5% to mutton, pork and chicken with the mass fractions of 0.5%, 1% and 5% to beef, and duck with the mass fractions of 1%, 2% and 10% to beef. The results show that the method has high accuracy and stability, and could be used to determine the content of 3 kinds of adulterated meat components in mutton and beef samples.

Reference:

HE L N, MA J M, LI Q, et al. Determination of ingredients in livestock and poultry meat based on liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Journal of Future Foods, 2022, 2(1): 53-60. DOI:10.1016/j.jfutfo.2022.03.017.

翻译/编辑：王佳红；责任编辑：孙勇

封面图片来源：图虫创意